Действие происходит в Римском университете Святого Иеронима в наши дни.

Действие I

Картина первая. Университет

Знаменитый ученый и закоренелый холостяк Дон Паскуале накануне своего 70-летнего юбилея решает жениться.

Он ждет доктора Малатесту, который, появившись, предлагает в качестве будущей избранницы свою сестру Софронию. Девушка воспитывалась в монастыре и полна добродетелей. Паскуале в нетерпении отправляет Малатесту за ней.

Будущий счастливый муж ликует и спешит сообщить новость о своей женитьбе подчиненным и племяннику Эрнесто, с которым он находится в затяжном конфликте. Несмотря на угрозы дона Паскуале лишить племянника средств к существованию, и даже жениться самому, оставив его вовсе без наследства, Эрнесто наотрез отказывается от выгодной партии, которую ему нашел дядя. Эрнесто упорно настаивает на своей любви к бедной молодой вдове Норине.

Новость о том, что женитьба Дона Паскуале не пустая угроза, приводит Эрнесто в смятение. Кроме того, он узнает от дяди, что его друг Малатеста его предал, поскольку он и есть устроитель дядиной помолвки.

Дон Паскуале, оскорбленный упрямством и издевками племянника, лишает его содержания и прогоняет на все четыре стороны.

Картина вторая. В доме Норины

Норина коротает утро за чтением романтических историй, примеряя их на себя. Ей приносят записку от Эрнесто, который прощается с любимой, отправляясь на чужбину. Матримониальные планы молодой женщины летят под откос.

Появляется Малатеста, который успокаивает расстроенную Норину и посвящает ее в детали нового плана: Норина должна выйти замуж за Дона Паскуале под видом простодушной и добродетельной Софронии. Кузен Малатесты Карлотто сыграет нотариуса. После того как фиктивный брачный контракт будет подписан, Норина должна устроить старику «веселую жизнь». Тогда есть шанс, что Паскуале одумается и согласится на свадьбу племянника с Нориной.

Малатеста и Норина репетируют образ наивной и бесхитростной Софронии и обсуждают детали интриги.

Действие II

Университет

Эрнесто прощается с alma mater, в которой прошли его детство и юность, и пишет очередное прощальное письмо возлюбленной.

Дон Паскуале готовится к смотринам. Малатеста приводит Норину под видом стеснительной Софронии. Дон Паскуале очарован и просит Малатесту немедленно послать за нотариусом, чтобы заключить брак.

Появляется «нотариус» – переодетый кузен Карлотто. На радостях Дон Паскуале отдает будущей жене половину состояния и делает ее единоличной и полноправной хозяйкой своих владений.

В момент подписания контракта в зал врывается Эрнесто, пришедший попрощаться с дядей. Он ошеломлен, обнаружив, что невеста и есть Норина: Малатеста, считая, что Эрнесто уже уехал, не оповестил друга. Теперь приходится тайком быстро вводить его в курс дела. В итоге Малатеста заставляет Эрнесто подписать брачный контракт Паскуале и «Софронии» в качестве недостающего свидетеля.

После того как все формальности исполнены, Норина преображается. Она резко заявляет о своих правах хозяйки и ставит на место Дона Паскуале. Затем созывает всех его подчиненных и начинает раздавать абсурдные приказы. Сотрудники университета растеряны, но подчиняются. Дон Паскуале обескуражен метаморфозой невесты и ощущает себя обманутым. Но контракт уже подписан.

Действие III

Картина первая. Университет

Норина и Малатеста радикально изменили сценарий предстоящего юбилейного празднества в честь Дона Паскуале. Полным ходом идет подготовка новой программы торжеств. Университетское сообщество изумленно наблюдает за происходящим. Дон Паскуале вынужден оплачивать многочисленные счета.

Он замечает Софронию-Норину, покидающую здание в вечернем платье. Несмотря на все скандалы, он все же надеется в первую брачную ночь наладить отношения с молодой женой. Паскуале делает попытку остановить супругу, но в ответ получает сначала издевки, а затем и пощечину. Он в отчаянии. Софрония-Норина уходит, незаметно подбрасывая записку от вымышленного влюбленного о назначенном вечером свидании. Дон Паскуале вне себя от ревности.

Коллеги Дона Паскуале обсуждают новые порядки и постоянные ссоры между супругами.

Малатеста отправляет Эрнесто в сад, играть мнимого любовника Софронии на свидании. Следом появляется опустошенный и раздавленный Дон Паскуале. Он жалуется Малатесте на жестокость и грубость Софронии. Более того, обвиняет ее в супружеской измене и хочет поймать жену на месте преступления, а затем вызвать полицию.

Малатеста утешает Дона Паскуале, и уговаривает его не предавать измену огласке. Если Софронию удастся уличить, то можно будет тихо потребовать развода. Дон Паскуале соглашается с этим планом, который должен принести ему отмщение и избавление.

Картина вторая. «Сад»

Эрнесто под видом неизвестного любовника Софронии поет серенаду. Затем они вместе с Нориной воркуют в любовном дуэте, чтобы привлечь внимание Дона Паскуале. Эрнесто скрывается.

Дон Паскуале намерен застать жену с любовником, но к его приходу Софрония-Норина уже одна. Она гневно отвергает и все его обвинения, и требования развода. Дон Паскуале в отчаянии и готов на все, лишь бы избавиться от брачных уз. Малатеста вызывается помочь, при условии, что ему будет предоставлен карт-бланш.

Малатеста в присутствии Дона Паскуале угрожает Софронии тем, что скоро ей придется делить полномочия хозяйки дома с другой женщиной – Нориной, на которой вскоре женится Эрнесто. Софрония негодует и теперь сама требует развода. Ради этого Паскуале теперь готов не только немедленно устроить свадьбу племянника, но и выделить молодым внушительную ренту. Он зовет Эрнесто и требует тотчас же сыграть свадьбу с Нориной.

Появляется Эрнесто. Вместе с Нориной и Малатестой они признаются в обмане. Дон Паскуале с облегчением узнает, что весь его брак – фальшивка, а Норина и Софрония – одна и та же женщина. Он прощает всех и желает влюбленным счастья.